BIM试剂盒教您如何选择正确的反转录方法

   逆转录PCR(RT-PCR)在实验室中经常被用于检测和量化样本中的RNA表达。实验的*步是通过逆转录(RT)将不稳定的RNA转化为互补的DNA(cDNA)。实际上，RT是许多用于研究RNA的分子生物学技术的*步，因为将不稳定的RNA转换为更稳定的DNA会使分析更容易、更可靠。对于RT-PCR,有一步法和两步法。
           

   在一步法RT-PCR中，RT反应和PCR扩增是在同一管中进行。将RNA模板添加到试管中，加有两种酶(逆转录酶和DNA聚合酶)，以及完成反应的所有必须组分。逆转录酶产生cDNA产物，然后逆转录酶和cDNA变性，DNA聚合酶扩增cDNA。在一步法中，RT反应由基因特异性引物启动。因此，只有感兴趣的区域被反向转录，然后进行扩增。

   在两步法RT-qPCR中，RT反应与PCR扩增单独进行。首先，RNA添加到反应混合物中，混合物包括逆转录酶和oligo-dTs (结合mRNA的poly-A尾巴)或随机六聚体(或两者都有)，合成cDNA。下一步，从管子中取出少量cDNA，置于一个新管中，作为PCR的模板与基因特定的引物一起混合。因为RT反应采用随机启动或由oligo-dTs进行启动，总RNA或总mRNA在RT步骤中被转录。尽管这两种方法都能得到zui终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

一步法RT-PCR：
优点: 只需一步，反应发生在单管中，速度比两步法更快，而且需要较少的准备和操作时间。
处理大量样品时易于操作，减少污染的机会。
整个cDNA样品都被扩增，灵敏度更高。
缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性，因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。
适用性：当时间对于实验很重要时，一般采用一步法。例如，迅速的一步法是RNA病毒检测的好方法，结果可以很快得到。也适用于高通量分析。 由于该方法采用基因特异性引物，所以通常是分析低表达水平基因的较好选择。此外，一步法是非常的，需要测量表达水平上的细微差异时这是一种常用的方法。

两步法RT-PCR：
优点: 可以分析同一样本的多个目标。
逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA，可以储存cDNA用于后续实验，检测大量基因。
能够分别优化RT和PCR步骤,可以更好地控制实验过程。
因为只有少量的转录材料用于PCR，任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂（如乙醇、苯酚或胍盐）都被稀释了。
缺点：它更耗费时间，且带来污染的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率，选择这种方法时，应该考虑到启动会影响qPCR的结果。例如，以oligo-dTs 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此，对于每个RT反应应该使用相同的条件。
适用性：选择两步方法的zui常见原因是对同一样本的多个目标进行分析。第二,当RNA的存储是个问题时,是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20°C是稳定的。此外，当起始材料有*，使用两步RT-PCR ，通常会有更高的cDNA产量。